1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定。本标准测定的是还原型维生素C和氧化型维生素C的总量。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
维生素C(抗坏血酸)在活性炭存在下氧化成脱氢抗坏血酸,它与邻苯二胺反应生成荧光物质,用荧光分光光度计测定其荧光强度,其荧光强度与维生素C的浓度成正比,以外标法定量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的三级水。
4.1 淀粉酶:酶活力1.5U/mg,根据活力单位大小调整用量。
4.2 偏磷酸—乙酸溶液A:称取15g偏磷酸及40mL乙酸(36%)于200m水中,溶解后稀释至500mL备用。
4.3 偏磷酸—乙酸溶液B:称取15g偏磷酸及40mL乙酸(36%)于100mL水中,溶解后稀释至250mL备用。
4.4 酸性活性炭:称取粉状活性炭(化学纯,80目～200目)约200g,加入1L体积分数为10%的盐酸,加热至沸腾,真空过滤,取下结块于一个大烧杯中,用水清洗至滤液中无铁离子为止,在110℃～120℃烘箱(5.3)中干燥约10h后使用。
检验铁离子的方法:普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与体积分数为1%的盐酸等量混合,将上述洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。
4.5 乙酸钠溶液:用水溶解500g三水乙酸钠,并稀释至1L。
4.6 硼酸—乙酸钠溶液:称取3.0g硼酸,用乙酸钠溶液(4.5)溶解并稀释至100mL,临用前配制。
4.7 邻苯二胺溶液(400mg/L):称取40mg邻苯二胺,用水溶解并稀释至100mL,临用前配制。
4.8 维生素C标准溶液(100μg/mL):称取0.050g维生素C标准品,用偏磷酸乙酸溶液A(4.2)溶解并定容至50mL,再准确吸取10.onL该溶液用偏磷酸—乙酸溶液A(4.2)稀释并定容至100mL,临用前配制。
5.仪器和设备
5.1 荧光分光光度计。
5.2 天平:感量为0.1mg。
5.3 烘箱:温度可调。
5.4 培养箱:45℃±1℃。
6.分析步骤
6.1 试样处理
6.1.1 含淀粉的试样:称取约5g(精确至0.0001g)混合均匀的固体试样或约20g(精确至0.0001g)液体试样(含维生素C约2mg)于150mL三角瓶中,加入0.1g淀粉酶(4.1),固体试样加入50mL45℃～50℃的蒸馏水,液体试样加入30mL45℃～50℃的蒸馏水,混合均匀后,用氮气排除瓶中空气,
盖上瓶塞,置于45℃±1℃培养箱(5.4)内30min,取岀冷却至室温,用偏磷酸—乙酸溶液B(4.3)转至100mL容量瓶中定容。
6.1.2 不含淀粉的试样:称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.0001g,用偏磷酸—乙酸溶液A(4.2)溶解,定容至100mL。或称取混合均匀的液体试样约50g(精确至0.0001g),用偏磷酸—乙酸溶液B(4.3)溶解,定容至100mL。
6.2 待测液的制备
6.2.1 将上述试样(6.1.1,6.1.2)及维生素C标准溶液(4.8)转至放有约2g酸性活性炭(4.4)的250mL三角瓶中,剧烈振动,过滤(弃去约5mL最初滤液),即为试样及标准溶液的滤液。然后准确吸取50mL试样及标准溶液的滤液分别置于25mL及50mL放有5.0mL硼酸—乙酸钠溶液(4.6)的容量瓶中,静置30min后,用蒸馏水定容。以此作为试样及标准溶液的空白溶液。
6.2.2 在此30min内,再准确吸取5.0mL试样及标准溶液的滤液于另外的25mL及50mL放有5.0mL乙酸钠溶液(4.5)和约15mL水的容量瓶中,用水稀释至刻度。以此作为试样溶液及标准溶液。
6.2.3 试样待测液:分别准确吸取2.0mL试样溶液(6.2.2)及试样的空白溶液(6.2.1)于10.0mL试管中,向每支试管中准确加入5.0mL邻苯二胺溶液(4.7),摇匀,在避光条件下放置60min后待测。
6.2.4 标准系列待测液:准确吸取上述标准溶液(6.2.2)0.5mL、1.0mL、1.5mL和2.0mL,分别置于10mL试管中,再用水补充至2.0mL。同时准确吸取标准溶液的空白溶液(6.2.1)2.0mL于10mL试管中。向每支试管中准确加入5.0mL邻苯二胺溶液(4.7),摇匀,在避光条件下放置60min后待测。
6.3 测定
6.3.1 标准曲线的绘制
将标准系列待测液(6.2.4)立刻移入荧光分光光度计的石英杯中,于激发波长350nm,发射波长430nm条件下测定其荧光值。以标准系列荧光值分别减去标准空白荧光值为纵坐标,对应的维生素C质量浓度为横坐标,绘制标准曲线。
6.3.2 试样待测液的测定
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